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PeproTech細胞因子和重組蛋白溶解必讀
南京森貝伽生物科技有限公司網上商城 / 2017-07-19

我們知道,PeproTech細胞因子和蛋白均為凍干粉,這使得運輸非常便捷,只要常溫即可。而且,細胞因子和蛋白凍干粉非常穩定,在-20o C或-80o C條件下可保存數年。凍干粉在使用前需進行溶解,然后以液體形式加到培養體系或注射入動物體內。溶解步驟非常關鍵,因溶解不好會導致細胞因子或蛋白的失活,這也是很多用戶在實際使用中經常遇到的問題。

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那么,應該如何進行正確的溶解呢? 

下面我們以Recombinant Human IL-4 (重組人IL-4,產品編號:200-04)的說明書為例,對PeproTech細胞因子或蛋白的溶解方法進行詳細的闡述。

拿到重組人IL-4的說明書后,您會發現有一段關于Reconstitution(重懸)的敘述,這段內容含有溶解相關的所有信息。

1. Centrifuge the vial prior to opening 

第 1 步:開蓋前離心試劑管 

PeproTech細胞因子或蛋白凍干粉裝盛在塑料管中,為無菌包裝。凍干粉在運輸過程中可能會因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上,所以在打開塑料瓶蓋前,需將凍干粉通過離心收集到管底,以便用很小體積的液體即可將凍干粉完全溶解。

有很多用戶會問一個問題,即應該用多少轉速、多長時間離心試劑管,才能達到良好的收集效果? 

答:有些小型高速離心機(多為進口品牌)的面板上有一個Spin鍵,按了此鍵后,離心機會自動快速上升到其最大速度(10000rpm或12000rpm),上升到最高點后速度即刻下降,直至停止旋轉,整個過程大約30s。這個Spin鍵足以很好的將細胞因子或蛋白收集到管底。

但有些實驗室沒有這樣的高速離心機,只有最高轉速為4000-4500rpm的離心機。這種情況下,需3000-3500rpm離心5min,也能達到類似的效果。

2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do not vortex. 

第 2 步:用無菌水重懸至 0.1-1.0 mg/ml ,不可振蕩。 

這個步驟即為溶解步驟,非常重要。

1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉

用于溶解細胞因子或蛋白的溶液千差萬別。此例中的重組人IL-4需用水溶解,而重組人IL-2 (產品編號:200-02)則需用100mM Acetic Acid (醋酸)溶解,重組人TGF-beta1 (產品編號:100-21)需用10mMCitric Acid (檸檬酸),pH3.0溶解,重組人FGF-basic(產品編號:100-18B)需用5mMTris,pH7.6溶解,重組人FGF-10(產品編號:100-26)需用5mMSodium Phosphate(磷酸鈉),pH7.4溶解,重組IL-13(產品編號:200-13)需用20mMMHCl溶解。(注:即使同一重組細胞因子或蛋白,不同批次的溶解方法也可能有所不同,因此上面的敘述僅供參考。具體應該如何溶解應以相應批次的官方說明書為準)。后續的文章中將對各種溶解液的配制方法進行詳細的闡述,望繼續關注。

經常有用戶會問,為什么會有這么多種溶解方法? 

答:我們知道,蛋白的溶解性與很多因素有關,其中比較重要的是pH值和離子強度。PeproTech的細胞因子或重組蛋白在出廠前均經嚴格測試,說明上所標明的溶解液是能夠將該細胞因子或重組蛋白完全溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強度與說明書中所標明的不符,很多時候會造成細胞因子或重組蛋白不能完全溶解或者根本無法溶解,這樣所配得的細胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。 

有不少用戶沒注意說明書上的描述,而是根據習慣,直接用PBS或培養液(1640或DMEM等)等溶解細胞因子或蛋白的凍干粉。這樣做可以嗎? 

答:有時可以,要看具體情況。PeproTech的大多數細胞因子或蛋白凍干粉的溶解液不是PBS,此時千萬不能用PBS或培養液直接來溶解,具體原因在上面已經敘述過。而有部分細胞因子,如重組人KGF(產品編號:100-19)和重組人FGF-23(產品編號:100-52)等,說明書上的溶解液即為1x PBS,此時用PBS溶解完全沒問題,那么用培養液溶解也是可以的,不過最好還是用先用PBS溶解,然后再用培養液稀釋。

2) 一定要溶解到指定的濃度。

蛋白在一定的濃度范圍內可以保持良好的穩定性,這個范圍就是說明書上所標明的濃度范圍,該例為0.1-1.0 mg/ml。這個濃度范圍對于不同的細胞因子或重組蛋白是不同的。如重組人FGF-6(產品編號:100-30)為0.5-1.0mg/ml,而重組人Activin B(產品編號:120-15)則一定要是0.5mg/ml。

高于或低于該濃度范圍會有什么問題呢? 

答:首先,細胞因子或蛋白會不穩定,即很容易出現活性下降的現象。其次,高于這個濃度范圍,可能會超過該蛋白的最大溶解濃度,即蛋白無法完全溶解。再者,高于或低于該濃度范圍,蛋白可能會出現聚集(aggregation),最終結果還是部分蛋白未溶解,導致蛋白活性的減弱。

3) 一定不能振蕩(vortex)。

這里所說的振蕩是指用渦旋儀進行快速振蕩。

有用戶會問,若想保證溶解液與凍干粉充分混勻,以實現細胞因子或重組蛋白的完全溶解,該怎么辦呢? 

答:多數細胞因子或重組蛋白的凍干粉是非常容易溶解的,一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下,即可使細胞因子或重組蛋白完全溶解。

對于不易溶解的細胞因子或蛋白,PeproTech會在說明書中進行備注(Note)。如在重組人IL-13(產品編號:200-13)的說明書中您會看到:Slow to dissolve (緩慢溶解),在重組人IL-11(產品編號:200-11)的說明中會看到: This solution is slow to dissolve.(該溶液溶解緩慢)。這種情況下,您最好能將要溶解的細胞因子或重組蛋白放在水平搖床(shaker)上低速搖一段時間,促使細胞因子或重組蛋白完全溶解。

有些蛋白,如重組人IL-13 Variant (產品編號:200-13A)雖然難溶,但卻不需用搖床來加速溶解。其說明書上的備注為:Allow the reconstituted vial to sit at 4oC for at > 2 hours before use. (將重懸液在4oC靜置2小時以上)

3. This solution can be stored at 2-8oC for up to 1 week. 

第 3 步:該重懸液在 2-8oC 最長可保存 1 周。 

用說明書上推薦的溶液將細胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后,PeproTech細胞因子或重組蛋白可放置在2-8o C,即冰箱的冷藏室。在這種條件下,細胞因子或重組蛋白的活性最長可保持1周。這對一個周期為5-7天的實驗,如DC(樹突狀細胞)的誘導成熟是足夠的。在此期間,只要每次從冰箱里吸取一定量的細胞因子或重組蛋白溶液加入到培養體系內即可。

其實,說明書上推薦的濃度對于一般的實驗來講是比較高的。所以用戶通常會將該溶液進一步稀釋后再放在4o C保存,待1周內用完。如進行稀釋,必須遵照下面第4步的方法,即需用含載體蛋白的溶液進行稀釋,否則稀釋后的細胞因子或重組蛋白很容易會粘附在管壁或瓶壁上,使得溶液中的細胞因子或重組蛋白的濃度下降,細胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。

4. For extended storage, it is recommended to further dilute in a buffer containing a carrier protein (example 0.1% BSA) and store in working aliquots at -20oC to -80oC. 

第 4 步:如要長期保存,則需用含載體蛋白 ( 如 0.1% BSA ,或 10% FBS ,或 5% HSA) 的溶液進一步稀釋,然后分裝凍存于 -20oC 至 -80oC 。 

如果一個實驗周期長于一周,或配制的細胞因子或重組蛋白一次用不完,我們就需對細胞因子或重組蛋白進行長期保存。方法是:將已重懸的細胞因子或蛋白用含載體蛋白,如0.1% BSA(牛血清白蛋白),10% FBS(胎牛血清),5% HSA(人血清白蛋白)的溶液將重懸液進一步稀釋,然后分裝凍存于-20o C至-80o C,即常規冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。

經常有人會在細胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后直接分裝凍存于-20oC至-80oC,這樣可以嗎? 

答:不行。我們知道,塑料管壁對多數蛋白均有很好的吸附作用,也就是說溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后,蛋白是很難與管壁分離的。做過ELISA實驗的人都知道,ELISA的包被抗體(Capture antibody)就是通過這種粘附作用包被到酶標板上的。

載體蛋白,如1% BSA,10% FBS (胎牛血清)和5% HSA等的主要作用是預先封閉塑料管壁上的蛋白結合位點,使細胞因子或重組蛋白不會粘附于管壁。如果在細胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后不用含載體蛋白的溶液進一步稀釋,而直接分裝凍存,則溶液中的大部分細胞因子或重組蛋白均會粘附到管壁上,導致溶液中實際溶解的細胞因子或重組蛋白的濃度大為降低,最終表現為細胞因子或重組蛋白活性的下降。

因此,在分裝凍存前,一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進一步稀釋。 稀釋后的細胞因子或重組蛋白可為任意濃度,因大量的載體蛋白可以保證低濃度細胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩定性。

那么,含載體蛋白的溶液指的是什么溶液呢?水可以嗎? 

答:水不可。該溶液通常是指pH近中性,有一定緩沖能力的緩沖液,如PBS,培養液(RPMI1640, DMEM等)等。

還有一個經常被問及的問題,即在做無血清培養或動物的體內實驗時,細胞因子中不能含有BSA,FBS或HSA等動物或人的蛋白,要想長期保存細胞因子或重組蛋白該怎么辦呢? 

答:一種方法是訂購PeproTech的小包裝(size A)細胞因子或重組蛋白,每次使用一只,用后即廢棄。如覺得該方法過于浪費,則可用海藻糖(Trehalose)作為載體,用含海藻糖的溶液來稀釋已重懸的細胞因子或重組蛋白,然后分裝凍存。

總之,為保證細胞因子或重組蛋白凍干份在重懸后仍能保持良好的生物活性,必須按照說明書中 Reconstitution 的方法嚴格操作。 

蛋白有價,實驗無價,愿大家珍惜每次實驗機會,嚴謹認真,每次均能得到預期的實驗結果!


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